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Come si analizza un test genetico? Cosa succede in laboratorio

Test genetico predittivo

Come si analizza un test genetico? Cosa succede in laboratorio

31 mar, 2022

Grazie ai prezzi sempre più accessibili e alla crescente consapevolezza dell’importanza della prevenzione e di uno stile di vita sano, la diffusione dei test del DNA per la salute e il benessere è un fenomeno in forte crescita. 

Sappiamo che, grazie a un test genetico predittivo, dall’analisi del DNA è possibile conoscere molti aspetti del nostro patrimonio genetico:

Abbiamo visto che un test di questo tipo generalmente viene eseguito su un campione di saliva prelevato con tampone buccale e analizzato con tecnologie di sequenziamento di ultima generazione di tipo Next Generation Sequencing (NGS).

Ma cosa succede esattamente quando un tampone arriva in laboratorio? Come viene analizzato il DNA? Come viene calcolata la predisposizione genetica individuale a manifestare una determinata condizione?

Scopriamolo insieme.

In questo articolo vedremo:

  1. L’estrazione del DNA
  2. Il sequenziamento NGS
  3. L’analisi bioinformatica dei dati
  4. L’interpretazione dei risultati
  5. La compilazione del report

L’estrazione del DNA

Quando un campione arriva in laboratorio, il primo passaggio è l’estrazione del DNA.

Se il campione è stato prelevato nel modo corretto, seguendo le istruzioni per la raccolta del materiale genetico con il tampone buccale, le cellule della mucosa orale rimangono adese alla superficie assorbente del tampone.

Per estrarre il materiale genetico dal tampone, si procede con la lisi cellulare, che consente la liberazione dell’acido nucleico dal suo involucro cellulare e nucleare, e con la purificazione, che consiste nell’isolamento del DNA dalle sostanze contenute nel campione che potrebbero ostacolare le fasi successive.

A questo punto, si procede con la valutazione di quantità e qualità del DNA estratto. Le condizioni affinché un campione sia ritenuto valido sono:

  • Quantità di DNA sufficiente (>25ng/ul)
  • DNA privo di contaminanti

Se un campione non rispetta entrambe queste condizioni viene scartato, poiché non si potrebbero eseguire correttamente le fasi di indagine successive.

Il sequenziamento NGS

Il passaggio successivo è il processamento del campione in preparazione al sequenziamento. In questa fase avviene la preparazione dei frammenti di DNA in "librerie" che verranno sottoposte al sequenziamento vero e proprio.

Il sequenziamento NGS è un protocollo di sequenziamento basato sulla chimica Sureselect QXT Target Enrichment Protocol (Agilent Technologies) che permette di sequenziare in parallelo milioni di frammenti di DNA. Questo metodo consente di ottenere risultati con una elevatissima sensibilità superiore al 99% e a costi contenuti.

Più nel dettaglio, il protocollo di sequenziamento NGS prevede 4 fasi:

  1. Sample preparation, ovvero la preparazione del campione tramite frammentazione enzimatica del DNA e amplificazione;
  2. Ibridazione e cattura, tramite l’utilizzo di sonde che si legano alle regioni di interesse del genoma;
  3. Indexing e pooling, rispettivamente l’”indicizzazione” dei frammenti di DNA con sequenze che fungono da “codici a barre” e permettono di distinguere campioni diversi in maniera univoca, e l’unione dei campioni in un’unica provetta;
  4. Caricamento dei campioni sul sequenziatore, il macchinario che esegue il sequenziamento vero e proprio.

La tecnologia di sequenziamento Illumina in uso nei laboratori netgenomics si articola in diversi passaggi:

  • I frammenti di DNA si legano alla flow cell, una sorta di "vetrino", supporto fisico sul quale avvengono tutte le reazioni dello strumento;
  • l’amplificazione (Bridge Amplification) genera per ciascun frammento 1000 copie identiche di DNA ‘’cluster’’, organizzate in microaree circoscritte della flow cell;
  • ‘’Sequencing by synthesis'': aggiunta di nucleotidi marcati con fluorofori diversi che permetteranno di ricostruire la sequenza dei singoli frammenti.

L’analisi bioinformatica dei dati

Al termine del sequenziamento, è necessario quindi procedere all’analisi bioinformatica per gestire ed interpretare le grandi quantità di informazioni derivanti dal sequenziamento. 

Il primo passaggio di questa fase è il Demultiplexing: ogni sequenza che era stata contrassegnata con un index viene assegnata al suo campione di origine.

Anche in questo caso, uno step fondamentale sono i controlli qualità, per es. tramite un Quality Score che misura la probabilità che la sequenza prodotta sia reale e che non si osservino degli artefatti legati ad errori avvenuti durante la fase di preparazione delle librerie o del sequenziamento

Verificata la qualità dei dati, si procede con l’Allineamento: i dati di sequenziamento vengono allineati con la sequenza di riferimento Homo Sapiens - human genome. Questa sequenza rappresenta il “genoma standard” per la specie umana riconosciuto a livello internazionale e costantemente aggiornato dal Genome Reference Consortium.

A questo punto avviene il confronto tra le due sequenze, quella individuale ottenuta dal sequenziamento e quella di riferimento, e si ricercano le varianti di interesse. Questo processo denominato Variant Calling permette l’identificazione delle sequenze che differiscono da quelle di riferimento del genoma umano, filtro di qualità che concentra l’analisi su dati che sono statisticamente supportati.

Tramite Variant Calling vengono rilevate le varianti genomiche presenti sulla sequenza target e in particolare si rilevano i polimorfismi a singolo nucleotide detti SNPs (pronuncia: snips).

Come abbiamo visto, un Single Nucleotide Polymorphism (SNP) è una variazione frequente del materiale genetico a carico di un singolo nucleotide - una singola “lettera” ATCG nella sequenza del DNA - che in alcuni casi può essere responsabile di variazioni nei livelli e/o nella funzione di una proteina e quindi portare ad una certa condizione nell’organismo.

Alcuni di questi polimorfismi possono infatti aumentare la predisposizione di un individuo ad una condizione sfavorevole. Ad esempio, è il caso dell’intolleranza al lattosio, causata da una scarsa o nulla produzione di enzima lattasi che viene regolata dal gene LCT: se nella sequenza del gene è presente in posizione rs182549 una T invece di una C, aumenta la predisposizione all’intolleranza.

Sulla base della presenza e del numero degli SNPs specifici rilevati nella sequenza target verrà calcolata la predisposizione individuale alla condizione indagata.

L’interpretazione dei risultati

Avendo ora una visione completa delle varianti di interesse rilevate, è il momento di interpretare i risultati con il calcolo della predisposizione.

La “formula” per il calcolo è piuttosto semplice e consiste nel dividere il numero di varianti rilevate nel campione per il numero totale di varianti considerate per una certa condizione, moltiplicato per 100:

(n° varianti rilevate / n° totale varianti indagate ) x 100

Facciamo un esempio pratico. Nel caso dello stress ossidativo vengono considerati in tutto 9 SNPs:

  • se viene rilevato 1 SNP → 1/9 = 0,11 x 100 = 11% predisposizione BASSA
  • se vengono rilevati 5 SNPs → 5/9 = 0,55 x 100 = 55% predisposizione MEDIA
  • se vengono rilevati tutti i 9 SNPs → 9/9 = 1 x 100 = 100% predisposizione ALTA

esempio-calcolo-predisposizione-stress-ossidativo

 

La compilazione del report

Una volta ottenuti i “punteggi” per ciascuna condizione indagata dal test, l’ultimo step è la stesura del report

Il report finale dell’indagine riporterà:

  • l’elenco completo delle varianti genetiche considerate per ogni condizione indagata dal test;
  • una panoramica dei risultati più significativi;
  • una pagina di approfondimento per ciascuna condizione di interesse, contenente il risultato dell’analisi, espresso in termini di predisposizione alta/media/bassa con relativa percentuale, e alcuni consigli pratici, utili a capire meglio il significato della predisposizione, a identificare le azioni migliori da mettere in atto per star meglio o a prevenire la comparsa di una condizione spiacevole.

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Team Netgenomics
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